1 mRNA簡介

上個(gè)世紀(jì)九十年代，在一系列體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)被突破的背景下，mRNA可以作為治療藥物的概念正式被提出來。隨后，由于結(jié)構(gòu)簡單、安全性好，以及可以誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)的特點(diǎn)，mRNA技術(shù)逐漸被開發(fā)為疫苗產(chǎn)品平臺(tái)。

理論上，mRNA疫苗具有眾多傳統(tǒng)疫苗不具備的優(yōu)點(diǎn)。首先，跟傳統(tǒng)疫苗相比較mRNA具有更強(qiáng)的免疫原性。mRNA可以表達(dá)特定序列的靶蛋白誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)，同時(shí)作為核酸類的免疫原，mRNA還可以誘導(dǎo)人體的天然免疫反應(yīng)（見下文），使其擁有“自我佐劑"（self-adjuvant）的特點(diǎn)，兩方面的作用，使得疫苗具有更強(qiáng)的免疫原性；第二，在安全性方面，mRNA疫苗的遞送不需要特定的質(zhì)粒載體，不進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)部，只需要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)抗原蛋白，不存在整合到人體基因組上的風(fēng)險(xiǎn)。第三，mRNA疫苗具有生產(chǎn)優(yōu)勢。在成本上mRNA疫苗的GMP生產(chǎn)成本是傳統(tǒng)疫苗的五到十分之一。另外，由于化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，生產(chǎn)和純化與抗原本身無關(guān)，同一條mRNA疫苗的生產(chǎn)線很容易被改造成符合EMA或FDA標(biāo)準(zhǔn)的不同抗原疫苗的生產(chǎn)線，因此，在應(yīng)對(duì)突發(fā)傳染病時(shí)，mRNA疫苗很容易在短時(shí)間內(nèi)完成研發(fā)和生產(chǎn)。

雖然在理論上mRNA疫苗有著突出的優(yōu)點(diǎn)，但是目前研發(fā)最快的產(chǎn)品還處于臨床試驗(yàn)階段。阻礙mRNA疫苗技術(shù)發(fā)展的zui大障礙是其對(duì)先天性免疫的激活，這種免疫反應(yīng)對(duì)mRNA疫苗來說是一把劍。一方面mRNA通過免疫激活來誘導(dǎo)機(jī)體的免疫保護(hù)，另一方面過度的激活先天性免疫可以阻止mRNA的翻譯，并降解mRNA（見下文）。從成藥性的角度來看，一款合格的mRNA疫苗產(chǎn)品要求其mRNA結(jié)構(gòu)足夠穩(wěn)定，能夠在靶細(xì)胞中遞送和表達(dá)并誘發(fā)預(yù)期的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。

2 mRNA誘導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)

先天性免疫是人體免疫系統(tǒng)的第一道防線，可以通過模式識(shí)別受體（Pattern Recognition Receptor，PRR）識(shí)別入侵抗原的病原相關(guān)模式分子（Pathogen-Associated Molecular Patterns，PAMP），然后通過一系列復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)部級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行免疫應(yīng)答。mRNA疫苗作為外源的核酸物質(zhì)，進(jìn)入體內(nèi)后會(huì)被一系列位于細(xì)胞表面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及細(xì)胞質(zhì)中的模式識(shí)別受體識(shí)別，并激發(fā)機(jī)體的先天性免疫應(yīng)答，正如上文所述，這種免疫應(yīng)答是一把“劍"。

研究發(fā)現(xiàn)，mRNA疫苗誘導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)可以促進(jìn)人體樹突狀細(xì)胞（Dendritic cell，DC）的成熟。成熟的DC進(jìn)一步向人體的免疫系統(tǒng)遞呈mRNA表達(dá)的靶抗原，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異的T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫，對(duì)人體產(chǎn)生預(yù)期的免疫保護(hù)效應(yīng)。從這個(gè)角度看，mRNA誘導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)是有利的。

mRNA疫苗作為一種單鏈RNA其本身也是一種PRR，其單鏈結(jié)構(gòu)和代謝產(chǎn)物可以激活細(xì)胞內(nèi)的Toll樣受體7（TLR-7）和Toll樣受體8（TLR-8），并最終激活I型干擾素介導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)，最終阻止mRNA表達(dá)并降解mRNA。另外，在體外進(jìn)行mRNA合成的過程中會(huì)產(chǎn)生雙鏈RNA（double-strand RNA，dsRNA）。dsRNA也是一種常見的的核酸類PAMP，污染了dsRNA的mRNA產(chǎn)品可以上調(diào)并激活蛋白激酶R和寡聚腺苷酸合成酶，隨后通過I型干擾素介導(dǎo)的免疫反應(yīng)阻止mRNA的翻譯及降解mRNA。從這個(gè)角度來看，mRNA誘導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)對(duì)產(chǎn)品本身有損害作用。這種有害的免疫反應(yīng)可以通過調(diào)節(jié)mRNA的核酸序列，在純化階段采用先進(jìn)工藝去除dsRNA等手段避免。

mRNA介導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)

3 mRNA的結(jié)構(gòu)及優(yōu)化策略

3.1 mRNA加帽

真核細(xì)胞mRNA的5'端有一個(gè)帽子結(jié)構(gòu)，它是在mRNA轉(zhuǎn)錄后，由甲基化的鳥苷酸（m7G）經(jīng)焦磷酸化與mRNA的5'端核苷酸相連。5'端帽子結(jié)構(gòu)在mRNA許多生物學(xué)功能中起到重要的作用，這包括：mRNA的剪切、穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運(yùn)和核糖體的募集等。由于5'端帽子結(jié)構(gòu)的重要生物學(xué)功能，在mRNA疫苗研發(fā)過程中需要優(yōu)化5'端帽子結(jié)構(gòu)，并利用合適的工藝對(duì)mRNA原料進(jìn)行“加帽"。

mRNA疫苗產(chǎn)品的加帽可以在mRNA的體外轉(zhuǎn)錄過程中通過摻入“帽子序列"實(shí)現(xiàn)，這種加帽技術(shù)會(huì)將加帽序列反向加在mRNA上，這會(huì)導(dǎo)致約1/3的加帽失敗。通過摻入特殊的帽子結(jié)構(gòu)——“anti-reverse"帽子結(jié)構(gòu)（ARCA）可以降低這種反向加帽失誤的出現(xiàn)。另外，還可以先合成不帶帽子結(jié)構(gòu)的mRNA，再利用痘病毒的“加帽復(fù)合物"對(duì)mRNA進(jìn)行加帽，這也是一種mRNA的加帽手段。

3.2 非翻譯區(qū)序列（UTRs）修飾

在mRNA的編碼區(qū)兩端各存在一段非翻譯區(qū)（UTRs），在5'端的被稱為5'端UTR，在3'端的被稱為3'端UTR。

非翻譯區(qū)序列不是密碼子，不能翻譯成氨基酸，但是可以通過RNA結(jié)合蛋白控制mRNA產(chǎn)品的降解和轉(zhuǎn)錄效率。因此，每一種mRNA疫苗都需要考慮如何設(shè)計(jì)產(chǎn)品的UTR組件，進(jìn)而提高在目的細(xì)胞中mRNA疫苗的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄效率。大量的研究發(fā)現(xiàn)非洲爪蟾和人源的α-球蛋白/β-球蛋白的UTR序列非常穩(wěn)定，而且能夠增加異源的mRNA的表達(dá)效率，因此這兩個(gè)蛋白的UTR原件通常被設(shè)計(jì)為mRNA疫苗的UTR組件。當(dāng)然，也有其它蛋白的UTRs被研究用于mRNA疫苗的組件，在此不再贅述。

3.3 Poly（A）

大多數(shù)真核生物的mRNA 的3'端都有由100~200個(gè)腺苷酸聚合形成的Poly（A）尾巴。mRNA的Poly（A）尾巴可以和5'端帽子結(jié)構(gòu)共同合作，增強(qiáng)mRNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。Poly（A）尾巴首先和大量的Poly（A）結(jié)合蛋白（PABP）結(jié)合，然后募集真核生物起始因子4G（eIF4G），增加Poly（A）跟5'端帽子結(jié)構(gòu)的親和力，最終mRNA的Poly（A）尾巴和5'端帽子結(jié)構(gòu)首尾相接，形成環(huán)裝mRNA。環(huán)裝mRNA結(jié)構(gòu)有利于核糖體的募集，其特殊的結(jié)構(gòu)也能保護(hù)mRNA不被降解。

在mRNA體外合成過程中，Poly（A）尾巴可以通過質(zhì)粒DNA模板轉(zhuǎn)錄獲得，也可以先合成mRNA再通過Poly（A）聚合酶加上不同單位數(shù)量的尾巴。前者能夠在mRNA產(chǎn)品中加入特定數(shù)目的Poly（A），而后者加入的單位數(shù)不確定。

Poly（A）尾巴的單位數(shù)目對(duì)于其生物學(xué)作用起到了至關(guān)重要的作用。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，活躍表達(dá)的mRNA包含的Poly（A）序列的長度為100-250個(gè)。有研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)效率越高的mRNA，其Poly（A）尾巴越短。但是當(dāng)Poly（A）單位長度小于12時(shí)，mRNA結(jié)構(gòu)就不再穩(wěn)定，容易被降解。在設(shè)計(jì)mRNA疫苗產(chǎn)品的序列時(shí)，Poly（A）的長度也是非常重要的優(yōu)化指標(biāo)。

3.4 開放閱讀框

開放閱讀框（Open Reading Frame, ORF）包涵了mRNA的全部編碼序列，負(fù)責(zé)進(jìn)入人體后表達(dá)mRNA運(yùn)載的抗原靶蛋白。

密碼子水平的修飾，利用常用的密碼子，選用tRNA較多的密碼子；使各個(gè)密碼子的比例更接近靶物種或者細(xì)胞的比例；

GC含量的修飾，避免復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)形成；二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)mRNA的延伸和轉(zhuǎn)錄非常重要，高穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)需要避免。這樣的二級(jí)結(jié)構(gòu)可以阻止核糖體的進(jìn)入、掃描以及容易被先天性免疫識(shí)別為PAMP。

4 mRNA疫苗分類

mRNA疫苗包括兩類：自我擴(kuò)增型（self-amplifying or replicon）以及非復(fù)制型（non-replicating or synthetic）的mRNA疫苗。

                    mRNA疫苗的兩種類型

自我擴(kuò)增型mRNA疫苗的設(shè)計(jì)通常是基于甲病毒屬（alphavirus）的病毒基因組。甲病毒屬為感染昆蟲的RNA病毒，用編碼抗原蛋白的mRNA代替甲病毒基因組上的甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白RNA，保留了甲病毒基因組自我復(fù)制的能力，又不能合成甲病毒蛋白。這類改造后的甲病毒基因組進(jìn)入體內(nèi)后可以自我復(fù)制產(chǎn)生編碼抗原蛋白的mRNA，很少的量就可以引起較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。

非復(fù)制型RNA疫苗則是在體外轉(zhuǎn)錄好的一段編碼抗原蛋白的完整mRNA，包括5?和3?的未翻譯區(qū)（UTRs），poly A tail用于穩(wěn)定mRNA和促進(jìn)轉(zhuǎn)錄；同時(shí)mRNA還有多種堿基修飾來提高mRNA的穩(wěn)定性，zui后利用納米脂質(zhì)體等遞送技術(shù)將mRNA遞送至細(xì)胞內(nèi)，從而翻譯抗原蛋白，引發(fā)免疫反應(yīng)，但是這種合成的mRNA在人體內(nèi)無法自我復(fù)制。

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